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 工业技术

HPLC-MS/MS法测定人痰液中哌拉西林的浓度

发布时间:2020-05-22 点击: 来源:工业工程
1 引言
哌拉西林(piperacillin)属酰脲类青霉素,抗菌谱广、抗菌作用强,对革兰阳性菌和革兰阴性菌均有良好的抗菌活性,是目前国内外广泛应用并被认为是最有价值的一类青霉素。多数抗生素在支气管分泌物和支气管黏膜的浓度可以间接反映抗生素治疗下呼吸道感染的疗效【1】,因此测定哌拉西林在呼吸道分泌物和肺组织中的浓度尤其重要【2】 , 以支气管分泌物中哌拉西林的浓度反映药物在肺部的浓度, 对于阐明哌拉西林局部浓度及其药效关系具有重要的意义, 因此本试验建立了测定痰液中哌拉西林浓度的HPLC-MS/MS。
目前国内有采用RP-HPLC-UV测定痰液中的莫西沙星的浓度,但是检测限偏高【3】。也有采用HPLC-MS/MS测定血浆和尿液中哌拉西林的浓度,但其检测限也偏高【4】,灵敏度较低。本实验采用高效液相-质谱联用法(HPLC-MS/MS)测定人痰液中哌拉西林的浓度,灵敏度高,耗时短,可用于痰液中哌拉西林的浓度测定及临床药动学和生物等效性的研究。
2 材料与方法
2.1材料与试剂
Agilent 1290高效液相色谱仪、Agilent 6490串联质谱仪(美国Agilent公司);涡旋混合仪(Scientific Industries公司),KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司),Sigma 1-14离心机(德国Sigma公司),Milli-Q 超纯水处理系统(美国Millipore公司);分析天平(梅特勒AG245,最小精度0.1 mg)。
哌拉西林标准品(中国药品生物制品检定所,货号130419),乙腈、甲酸均为色谱纯;水为去离子水。
2.2 哌拉西林标准溶液的配制
哌拉西林标准储备液(1000 mg/L)的配制:准确称取10 mg哌拉西林标准品(精确至0.0001 g),用水溶解定容至10 mL,配制成1 g/L的标准储备液;然后再取适量标准储备液用水稀释成10 mg/L中间液。
标准工作液的配制:取一定量的中间液用乙腈:水(1:9)逐级稀释,分别配制浓度为0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0、500.0、1000.0、2000.0μg/L的标准系列工作液。
2.3 色谱条件
色谱柱:Agilent Eclipse Plus C18(1.8 μm, 2.1×50 mm),配在线过滤器(Agilent公司);流动相A为水,B为乙腈;梯度洗脱程序:0-1 min,5% B;1-3 min,5%-80% B;3-3.5 min,80% B;3.5-4 min,80%-5% B;4-5 min,5% B;柱温:35 ℃;流速:0.4 mL/min ;进样体积:5 μL。
2.4 质谱条件
电离源:ESI-;毛细管电压:3 000 V;雾化气压力:20 psi;鞘气温度:300 ℃;鞘气流量:11 L/min;干燥气温度:250 ℃;干燥气流量:14 L/min;采集方式:多反应监测模式(MRM)。哌拉西林质谱参数见表1。
表1 哌拉西林质谱参数
Table 1 MS parameters of Pipracil
Compound Parention[M-H]- Fragment ion Collision voltage (V)
哌拉西林 516.1 329.9* 5
  233.0 15
2.5 样品制备
取100 μL痰样品于1.5 mL 离心管中,加入900 μL乙腈涡旋混匀,12000r/min离心6 min。上清液全部转移至收集管中,氮气吹干后用1 mL乙腈-水(v:v=1:9)溶解,过0.22 μm滤膜(有机膜),待上机检测。
3 结果与讨论
3.1  方法的线性关系和检出限
配置系列浓度的标准工作溶液,在选定的色谱、质谱条件下测定,以标准工作溶液的浓度为横坐标,以定量离子提取色谱峰面积为纵坐标,选取8个点的浓度绘制标准曲线。根据各定量离子约3倍信噪比(S/N)对应的该待测物的浓度,计算得到检出限(LOD),哌拉西林的线性方程、相关系数(r2)、检出限(LOD)见表2,标准曲线见图2。
表2哌拉西林的线性方程、线性范围、相关系数(r2)、检出限(LOD)
Analyte Linear range(μg/L) Calibration equations r2 LOD(μg/L)
哌拉西林 0.2-200 Y=440.446218*X-421.110223 0.99931168 0.2